前 言

本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东阿胶行业协会提出。

本标准由山东标准化协会归口。

本标准主要起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东省食品药品检验研究院。

本标准参与起草单位：山西广誉远国药有限公司、天津中新药业集团股份有限公司、山东百味堂中药饮片有限公司、山东建联盛嘉中药有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司。

本标准主要起草人：胡悦、刘艳艳、张全芳、范阳阳、汪冰、陈雪燕、刘国霞、司家勇、董书光、王兴刚、孟朝红、许晶晶、步迅、林永强。

阿胶质量 DNA 控制规范

1 范围

本标准规定了阿胶质量DNA控制的总则、阿胶生产质量DNA控制要求、阿胶验收质量DNA控制要求、和不合格品处置。

本标准适用于阿胶生产企业及阿胶应用企业基于动物源性DNA鉴定技术对阿胶产品进行验收的质量控制管理。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 14881 食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范

GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

DB37/T 3533—2019 驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法

《中华人民共和国药典》

《山东省中药材标准》

3 阿胶质量DNA控制总则

为确保阿胶质量安全，防止掺杂其他动物源性成分，阿胶生产企业在符合GB 14881和GMP规范的基础上，应符合以下基本原则：

a) 按照本标准的要求进行阿胶生产全过程 DNA 质量控制；

b) 建立阿胶质量 DNA 控制管理追溯体系。

4 阿胶生产质量 DNA 控制要求

4.1 原料验收质量DNA控制

4.1.1 总体要求

4.1.1.1 阿胶生产企业与供应商资质审批并对其质量管理体系评审，签订质量保障采购合同或协议，应明确使用DNA技术鉴定原料，并接受鉴定结果及相关处置要求。

4.1.1.2 原料进场时进行验收，填写皮张入库接收记录,详细记录到货日期、供应商名称、进厂批号、产地、张数、毛重、外观是否合格、存放位置以及是否为驴皮或疑似皮张，是否进行 DNA 检验等信息。

4.1.1.3 库区应单独设置 DNA 待验区，存放疑似待验的皮张。

4.1.2 验收要求

4.1.2.1 符合性要求：

a) 驴皮应符合《山东省中药材标准》驴皮项下性状要求，且不得有马皮、牛皮、骡皮或其他杂皮；

b) 不得有腐烂、变质、虫蛀、带有头骨、腿骨或蹄子的驴皮；

c) 不得有皮质颜色发蓝或皮板大部分脱毛的皮；

d) 不得有驹皮；

e) 不得有块皮、单独嘴唇、耳朵、蹄子、尾巴。

4.1.2.2 技术要求：

对疑似皮，按照DB37/T 3533—2019规定的方法进行鉴定。

4.1.3 验收程序

4.1.3.1 符合性检查

由原料供应商及生产企业相关部门对驴皮按4.1.2.1进行检查，发现杂皮、疑似皮，经双方协商，可进行技术验收。

4.1.3.2 技术鉴定

对挑选出的外观特征难以鉴别的疑似皮，进行标记、编号，并在每张皮的耳部、腹部、腿部各取约5 cm×5 cm的块皮，放入取样袋中，做好标记，由专人将样品送至DNA检测机构按4.1.2.2进行动物源性DNA鉴定。根据动物源性DNA鉴定结果，鉴定为驴皮的入库处理；鉴定为非驴皮的按不合格原料处理，并做好相应的DNA检测记录。

4.2 生产过程质量DNA控制

4.2.1 阿胶生产企业通过 DNA 检测机构，对每个生产批次的阿胶产品在化皮阶段、除沫提杂阶段设置中间体产品取样点。

4.2.2 每阶段取两个平行样，每个样品取样量为 30 mL～50 mL。

4.2.3 样品应注明名称、生产批号、取样阶段、取样时间及取样人。

4.2.4 样品应在 2 ℃～10 ℃冷藏，贮存时间为 7 d～15 d。

4.2.5 样品应冷链运输，送至 DNA 检测机构进行检验，检验方法见附录 A。

4.3 成品质量 DNA 控制要求

阿胶生产企业应在批次产品包装结束后，按批次分取其中12 g～25 g样品，密闭保存，按附录A的规定检验。

4.4 质量控制追溯要求

阿胶生产企业的质量控制追溯管理应符合以下要求：

a) 建立驴皮验收，中间体产品和成品取样、送检、验收/检验、仓储、运输等过程的记录，记录内容应真实、完整，至少保留至产品效期后一年；

b) 保留原料驴皮批号、数量和重量等原始记录，保证原料驴皮 DNA 鉴定数据可追溯；

c) 同步建立和实施可追溯性系统，确保能够长期识别阿胶产品批次及其与原料批次、生产和交付记录的对应关系；

d) 依据阿胶生产全过程动物源性 DNA 鉴定报告，建立每批次阿胶的“DNA 溯源”备份查询系统，保证采购方随时能查询到该批次动物源性 DNA 鉴定报告；

e) 按规定期限保持可追溯性记录，以便对质量管理体系进行评估，对潜在不合格产品采取纠正措施；

f) 可追溯性记录应符合法律、法规的要求。

5 阿胶验收质量 DNA 控制要求

5.1 验收要求

阿胶使用单位应要求阿胶生产企业提供的阿胶产品符合以下要求：

a) 符合《中华人民共和国药典》阿胶的标准要求；

b) 阿胶原料、中间体和成品应符合 DNA 源性批间质量一致性的要求，出具 DNA 检测机构的动物源性 DNA 鉴定报告。

5.2 入库要求

阿胶使用单位在阿胶产品入库时应检查以下内容：

a) 应附有批产品的出厂检验报告及 DNA 检测机构出具的动物源性 DNA 鉴定报告；

b) 产品外包装应无破损、受潮、水渍、霉变、鼠咬、虫蛀等现象；

c) 产品应双层包装，封口严密, 每件包装上应标有明显标志，注明批准文号、品名、批号、规格、数量、生产厂家、生产日期、有效期、储藏条件、运输标志等，并附有产品合格证。

6 不合格品处置

6.1 对发现的不合格阿胶产品应隔离存放，并设置明显的“不合格”标识。

6.2 经动物源性 DNA 分子鉴定不合格的，按不合格品处理。

附 录 A

（规范性附录）

阿胶半成品及成品DNA源性鉴定 实时荧光定性 PCR 法

A.1 原理

以核基因CKM(creatine kinase of muscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定动物驴、马和骡3种动物源性成分。

A.2 试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

A.2.1 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0）溶液：称取12.1 g三羟甲基氨基甲烷置于100 mL烧杯中，加入80 mL水，用浓盐酸调节pH至8.0，转移至100 mL容量瓶中,加水定容至刻度，103.4 kPa蒸汽压（121 ℃）灭菌20 min，室温保存待用。

A.2.2 1 mol/L Tris-HCl (pH 6.4）溶液：称取12.1 g Tris置于100 mL烧杯中，加入80 mL水，用浓盐酸调节pH至6.4，转移至100 mL容量瓶中,加水定容至刻度，103.4 kPa蒸汽压（121 ℃）灭菌20 min，室温保存待用。

A.2.3 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液：称取18.61 g二水乙二胺四乙酸二钠置于100 mL烧杯中，加入80 mL水，用10 %的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 kPa蒸气压（121 ℃）灭菌20 min，室温保存待用。

A.2.4 10 % SDS：称取10 g十二烷基硫酸钠溶解于80 mL无菌水中，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。

A.2.5 5 mol/L氯化钠溶液：称取29.22 g氯化钠溶解于80 mL无菌水中，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 kPa蒸汽压（121 ℃）条件下灭菌20 min，室温保存待用。

A.2.6 细胞裂解液（Lysis Buffer）：取1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）20 mL，0.5 mol/L 二水乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）5 mL，5.0 mol/L 氯化钠 10 mL，10 %十二烷基硫酸钠5 mL，转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

A.2.7 20 mg/mL蛋白酶K溶液：称取0.2 g蛋白酶K冻干品，加水溶解，转移至10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于-20 ℃保存。

A.2.8 5 % Chelex-100树脂：称取5 g Chelex-100树脂，溶解于100 mL水中。

A.2.9 硅珠悬浮液：取5 g的硅胶加入到20 mL的水中充分混合，静止24 h，弃掉上清液，然后再加入20 mL的水中充分混合，再静止5 h，弃掉上清液。在沉淀的硅珠中加入5 mL的水，再加入5 µL的浓盐酸，充分混合，调节pH至2.0。

A.2.10 DNA结合液：称取60 g异硫氰酸胍，加入5 mL 1mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液，再加入8 mL0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0），然后再加入4 mL Trition X-100溶液（温度60 ℃），转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

A.2.11 漂洗液：称取60 g异硫氰酸胍，加入5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液，再加入8 mL0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

A.2.12 TE缓冲液：量取0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）加入到容量瓶中，调节pH 至8.0，转移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4 kPa蒸汽压（121 ℃）灭菌20 min，降至室温，4 ℃保存备用。

A.2.13 RNA酶溶液：将1 g冻干品RNA酶A溶解于6 mL 无菌水中，于100 ℃加热15 min，缓慢冷却至室温，加水定容至10 mL，分装成小份存于-20 ℃。

A.2.14 2×TaqManMaster Mix：含有Taq DNA聚合酶（终浓度1 U/20 µL）、Mg2+（终浓度2.0 mmol/µL）、dNTPs（终浓度0.2 mmol/µL）。

A.2.15 引物和探针：

内标质控引物探针序列和马属动物通用PCR引物、驴和马的特异性探针序列见表A.1。

表A.1实时荧光定性PCR引物和探针序列

A.3 仪器设备

A.3.1 实时荧光定量PCR仪：4通道以上。

A.3.2 电子分析天平：感量0.1 mg或0.01 g。

A.3.3 离心机：最大离心力不小于13000 g。

A.3.4 振荡型恒温金属浴：0 ℃～100 ℃。

A.3.5 高压灭菌锅。

A.3.6 低温冰箱：-20 ℃～4 ℃。

A.3.7 超净工作台。

A.3.8 紫外分光光度计。

A.4 试验步骤

A.4.1 样本制备

吸取阿胶中间体的阿胶液500 µL于2.0 mL离心管中。阿胶块用研磨机粉碎，称取约2.0 g阿胶粉，平分至4个2.0 mL离心管中。

A.4.2 阿胶中间体及成品DNA提取方法

A.4.2.1 加入400 µL的DNA提取细胞裂解液（A.2.6）和10 µL蛋白酶K溶液（A.2.7），放置振荡型恒温金属浴中，56 ℃ 800 r/min裂解3 h～5 h，直至全部裂解。加100 µL 5% Chelex树脂（A.2.8），煮沸8 min，8000 g离心3 min，取上清液至新1.5 mL 离心管中。加入10 µL硅珠悬浮液（A.2.9）、800 µLDNA结合液（A.2.10），充分混匀，静置5 min，8000 g离心1 min，弃去上清液。加入700 µL 漂洗液（A.2.11），涡旋振荡使沉淀悬浮，8000 g离心1 min，弃去上清液。加入700 µL 70 %乙醇洗涤，8000 g离心1 min，弃去上清液，重复洗涤2次。8000 g离心30 s，吸走残余液体，室温干燥10 min，待乙醇完全挥发，加入50 µL 0.1×TE缓冲液（A.2.12）溶解DNA，加入1 µL RNA酶溶液（A.2.13），37 ℃温浴5 min，8000 g离心1 min，吸取上清液转移至新离心管中，-20 ℃保存备用。

A.4.2.2 用紫外分光光度计检测提取的DNA浓度与纯度，测定OD260 nm和OD280 nm处吸光值，OD260/OD280比值在1.7～1.9范围内，试验用DNA浓度在0.1 ng/µL～50 ng/µL范围内。

注：可采用经验证的动物组织DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。

A.4.3 实时荧光PCR反应

A.4.3.1 试样实时荧光PCR检测

多重实时荧光PCR：将驴、马和骡进行多重实时荧光PCR，PCR反应体系中包括驴和马2种动物源性的特异探针，并加入内标质控体系。PCR反应体系见表A.2。

表A.2多重实时荧光PCR反应体系

A.4.3.2 对照实时荧光PCR反应体系 每个PCR反应设置3次平行。在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照：

a) 空白对照：以水作为空白对照；

b) 阴性对照：以3种动物之外的动物基因组 DNA 为阴性对照；

c) 阳性对照：将驴、马和骡 3 种动物基因组 DNA 等量混匀作为阳性对照。 

A.4.3.3 实时荧光PCR反应体系配制

按照表A.2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入模板DNA，3000g离心1 min，取出PCR管，放入荧光定量PCR仪中。

A.4.3.4 实时荧光PCR反应程序

95 ℃预变性3 min；95 ℃ 变性10 s，62 ℃退火延伸35 s，40个循环。

A.5 试验数据处理

A.5.1 PCR有效性判定

阳性对照、阴性对照和空白对照全部满足以下条件，表明PCR体系有效:

a) 空白对照：CY5 有荧光扩增曲线，且 Ct 值≤35.0；FAM 和 JOE 无荧光扩增曲线；

b) 阴性对照：CY5 有荧光扩增曲线，且 Ct 值≤35.0；FAM 和 JOE 无荧光扩增曲线；

c) 阳性对照：有 FAM、JOE 和 CY5 荧光扩增曲线，且 Ct 值≤35.0。

A.5.2 检测结果分析和表述

A.5.2.1 试样中若有FAM、JOE和CY5荧光扩增曲线，且Ct值≤35.0，则判定样品中检出骡源性成分,或马和驴源性成分。

A.5.2.2 试样中仅有FAM、CY5荧光扩增曲线，且Ct值≤35.0，则判定样品中检出马源性成分。

A.5.2.3 试样中仅有JOE、CY5荧光扩增曲线，且Ct值≤35.0，则判定样品中检出驴源性成分。

A.5.2.4 试样中若有FAM和JOE荧光扩增曲线，但35.0＜Ct值＜40.0，则需要加大模板量进行PCR反应。

若再次扩增后的Ct值＜40.0，则根据A.5.2.1～A.5.2.3判定样品中检出相应的动物源性成分，若Ct值≥40.0，判定样品中未检出驴、骡和马源性成分。

A.5.2.5 试样中若无FAM和JOE荧光扩增曲线，仅有CY5荧光扩增曲线，且Ct值≤35.0，判定样品中未检出驴、骡和马源性成分。

A.5.2.6 实验中若无FAM、JOE和CY5荧光扩增曲线，判定该样品检测失败，PCR反应失败。注意以下几个方面后再次进行反应：

a) 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品 DNA 制备有问题，如样品中可能存在抑制物等。

b) 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。

A.6 检测过程中防止交叉污染的措施

防治污染的措施按GB/T 27403规定执行。

山东标准化协会  发布